Polümeraasi ahelreaktsiooni meetodi täielik kirjeldus

Polümeraasi ahelreaktsioon (PCR) on inimese DNA lühikese osa mitme eksemplari loomine. Väike kogus füsioloogilist materjali on vajalik uuringute ja tulemuste saamiseks: röga, veri, amnionivedelik, sülg, uriin jne.

Mis on polümeraasi ahelreaktsioon?

PCRi meetod on välja töötanud Ameerika teadlane Melison, kes sai 1998. aastal Nobeli preemia oma arengu eest. Aktiivselt kasutatud:

• infektsioonide varajase diagnoosimisega, onkoloogiliste patoloogiatega;
• kohtuekspertiisi äärmiselt väikese koguse DNA uurimiseks;
• veterinaarmeditsiinis, bioloogias, molekulaarses geneetikas;
• DNA identifitseerimiseks;
• isaduse kinnitamiseks;
• ökoloogias, näiteks toote kvaliteedi jälgimisel, antropoloogias.

Kellele on määratud PCR?

Polümeraasi ahelreaktsioon nakkuslike patoloogiate diagnoosimisel on üks kõige usaldusväärsemaid meetodeid, mis annab kõige täpsema ja usaldusväärse analüüsi. Näiteks on klamüüdia analüüsi usaldusväärsus ligi 100%. Kõige sagedamini määratakse see diagnostiline meede patsientidele, kellel on katse ajal raskusi konkreetse patogeeni tuvastamisega.

PCRi laboratoorsete testide kasutamine:

1. Uriini- ja suguelundite infektsiooni põhjustavate patogeensete organismide otsimiseks on kultuuride või immunoloogilise meetodi rakendamisel raske tuvastada.
2. HIV-i taasanalüüsimiseks algfaasis positiivse, kuid küsitava tulemusega, näiteks nakatunud vanemate vastsündinutel.
3. Onkoloogilise patoloogia loomine varases staadiumis ja ravirežiimi individuaalne korrigeerimine patsientidel.
4. Pärilike patoloogiate varajaseks avastamiseks ja potentsiaalseks raviks. Nii testivad paljud tulevased vanemad, kas nad on geneetiliste haiguste kandjad. Laste puhul määrab see meetod pärilike haigustega kokkupuute tõenäosuse.

Seda meetodit kasutatakse ka:

• loote patoloogia avastamiseks raseduse alguses;
• patsientidel enne elundite siirdamist - on vajalik kudede kokkusobivuse määramiseks
• tuvastada doonori veres ohtlikke patogeene;
• vastsündinutel peidetud nakkuste avastamiseks;
• hinnata viirusevastase või antimikroobse ravi tulemusi.

Miks seda menetlust läbi viia?

Kuna PCR on väga tõhus diagnostiline meetod, mis annab peaaegu 100% tulemusi, kasutatakse seda protseduuri:

1. Diagnoosi kinnitamiseks või välistamiseks.
2. Ravi efektiivsuse kiireks hindamiseks.
3. Paljudel juhtudel peetakse seda meetodit ainsa võimaliku patoloogia avastamise võimaluseks, kui teised bakterioloogilised, viroloogilised meetodid on osutunud kasutuks.
4. PCR protseduuri kasutavad viirused tuvastatakse kohe pärast nakatamist ja enne peamiste sümptomite algust.
5. Mikroorganismide varajane avastamine võimaldab kiiret ravi.

Lisaks võimaldab PCR-analüüs kiiresti tuvastada väikese arvu mikroorganisme elus või surnud proovides. Seetõttu kasutatakse seda meetodit spetsiifilise patogeensete organismide, näiteks tuberkuloosiga, otsimiseks.

Lisaks kasutatakse PCR analüüsi:

• määrata DNA tundlikkus teatud tüüpi antibiootikumidele, mis võimaldab ravi võimalikult kiiresti alustada;
• kontrollida epideemiate levikut;
• tuvastada ja jälgida uusi mikroobide, patogeenide tüüpe.

PCR põhiliigid

Standardmeetod

PCR analüüs viiakse läbi spetsiifilise DNA fragmendi ja RNA mitmekordse kahekordistamise alusel, kasutades praimeri ensüüme. Tänu sellele saab teadlane vajaliku koguse materjali.

Reaalaja PCR

Sellises uuringus alustatakse konkreetse fragmendi tuvastamise protsessi pärast iga tsükli läbimist. Seda tüüpi uuringud võimaldavad saada teavet viiruste ja mikroorganismide arvu kohta kehas, st kvantitatiivse analüüsi läbiviimiseks.

Pöördtranskriptsiooni režiim PCR-ist

Seda analüüsi kasutatakse üheahelalise RNA otsimiseks viiruste edasiseks avastamiseks, mille geneetiline alus on RNA. Näiteks on see C-hepatiidi viirus, immuunpuudulikkus jne. Selle uuringu läbiviimisel kasutatakse spetsiaalset ensüümi, tänu millele ehitatakse üheahelaline DNA. Seejärel taastab süsteem teise DNA ahela ja täidab traditsioonilise protseduuri.

Näidustused

PCR-protseduuri kasutatakse nakkushaiguste, sünnitusabi, uroloogia, günekoloogia ja nefroloogia, pediaatrias jne. Kõige tavalisemad määramisanalüüsid on järgmised:

• määrata kindlaks geneetiliste kõrvalekallete tekkimise oht lapsel pärilike patoloogiate juuresolekul;
• diagnoosida mõlemad vanemad raseduse planeerimisel või kui ema on lapse kandmise ajal raskes seisukorras;
• viljatuse põhjuste kindlakstegemise raskustega;
• seksuaalsete infektsioonide kahtluse korral ägedas staadiumis või kroonilisele staadiumile ülemineku ohus;
• tundmatu päritoluga põletikuliste protsesside põhjuste avastamiseks;
• kaitsmata juhusliku seksiga;
• patogeensete mikroorganismide tundlikkuse määramiseks konkreetsele ravimile;
• kahtlustatav latentne nakkus patogeenide avastamiseks ilma ilmse sümptomita;
• kinnitada haigusest taastumist, st retrospektiivset diagnoosi.

Samuti kasutatakse PCR-i, kui on vaja täpselt tuvastada sellised patogeenid nagu: hepatiidi viirused, inimese immuunpuudulikkus, tsütomegaloviirus, herpes simplex viirus, punetiste viirus, papilloomiviirus.

Seal kasutatakse seda meetodit nakkuste kindlakstegemiseks: nakkuslik mononukleoos, puukentsefaliit, kandidoos, mis on põhjustatud Candida seentest, suguelundite infektsioonidest ja tuberkuloosist.

Kui vastunäidustused ja ohutu meetod?

Kuna see protseduur viiakse läbi ilma keha mõjuta ja kasutatakse ainult bioloogilist materjali, mida kasutatakse uurimistööks, ei ole organismi võimaliku ohu puudumise tõttu vastunäidustusi. Kuid näiteks emakakaela emakakaela biomaterjali proovide võtmine ei toimu pärast kolposkopiat. Kohaletoimetamise määrdumine, kraapimine on lubatud ainult 4-7 päeva pärast menstruatsiooni lõppu ja tühjendamise täielikku lõpetamist.

Protseduuri ettevalmistamise tunnused

PCR analüüsi prooviks, milles tuvastatakse võõra patogeeni DNA, kasutatakse kas bioloogilist vedelikku või koet. Uuritava aine tarbimine toimub vereproovina veenist, ninaõõne, kõri, emakakaela, kusiti. Enne diagnostilist protseduuri peab arst patsiendile selgitama, millist materjali võetakse:

• herpesinfektsioonide analüüsimisel võtab mononukleoos läbi nii uriini analüüsi kui ka neelu neelu;
• hepatiidi või toksoplasmoosi testimisel võetakse verd veest;
• mitmesuguste kesknärvisüsteemi kahjustuste diagnoosimiseks võetakse tserebrospinaalvedelik;
• pulmonoloogias on PCR analüüsi proovid pleura vedelik ja röga;
• kui ta teeb raseduse ajal emakasisene infektsioonide uuringu, kasutatakse analüüsiks platsenta rakke.

Tulemuse usaldusväärsus ja täpsus sõltub biomaterjali steriilsusest ja võtmise tingimustest. Kuna PCR-uuringud on väga tundlikud, võib mis tahes võetud aine saastumine tulemusi moonutada. Biomaterjali kohaletoimetamise pädev ettevalmistus ei tekita patsiendile raskusi.

Kuid on mitmeid soovitusi:

• sugulisel teel levivate nakkuste analüüsimisel on vaja intiimsed kontaktid välja jätta kolm päeva enne materjali kohaletoimetamist;
• 72 tundi peaks lõpetama mistahes vaginaalsete preparaatide kasutamine;
• eelmise päeva õhtust alates ei saa uuritud alade hügieeni läbi viia
• 3-4 tundi enne proovi võtmist kusiti, tuleb urineerimine välja jätta;
• üks kuu enne testide tegemist peate antibiootikumide võtmise lõpetama;
• enne söömist ja joomist antakse hommikul tühja kõhuga verd;
• Pärast tualetti sisenemist kogutakse hommikune uriin steriilsesse mahutisse.

Kuidas on PCR?

Teadusuuringute tegemisel erireaktoris kordub teatud tsükkel:

1. Esimene samm. Denaturatsioon. Sülg, veri, günekoloogilised testid ja muud ained pannakse aplikaatorisse, kus materjali kuumutatakse ja DNA jagatakse kaheks ahelaks.
2. Teine samm. Kergelt jahutatud aine, lisades sellele spetsiaalsed komponendid, mis tunnevad ära DTC molekuli vajalikud osad ja seovad sellega.
3. 3 samm. Pikenemine Protsessi käigus on lõppenud patogeensete organismide DTC fragment, moodustub selle koopia. Seda tsüklit korratakse, mis kahekordistab spetsiifilise DNA fragmendi koopia.

Paari tunni pärast moodustub selle fragmendi paljud koopiad, nende esinemine proovides ilmneb. Seejärel võrreldakse tulemusi erinevate patogeenide andmebaasidega. See võimaldab määrata nakkuse tüübi.

Dekodeerimise analüüsi omadused?

Uuringu lõpptulemus antakse patsiendile mitu päeva pärast bioloogilist analüüsi.

Kvalitatiivne analüüs

Sellisel juhul on negatiivne tulemus see, et testimiseks esitatud vedelikus ei tuvastatud nakkusetekitajat. Positiivne tulemus näitab patogeensete viiruste või bakterite avastamist bioloogilises proovis. Kui tulemus oli positiivne, kuid samal ajal ei ole inimesel nakkuse aktivatsiooni märke, nimetatakse sellist keha seisundit asümptomaatiliseks tervislikuks kandjaks.

Kõige sagedamini on see täheldatud biomaterjali kasutamisel viiruse patoloogiates. Sellisel juhul ei ole ravi vajalik, kuid see nõuab pidevat meditsiinilist järelevalvet. Kuna sellistel tingimustel on tõenäosus:

• viiruse levik kandjalt tervetele inimestele;
• protsessi aktiveerimine ja patoloogia üleminek kroonilisele vormile.

Kvantitatiivne analüüs

Kvantitatiivse tulemuse määrab spetsialist konkreetselt teatud tüüpi nakkuse jaoks. Saadud tulemuste põhjal on võimalik hinnata arengutaset, patoloogia staadiumi, mis võimaldab määrata ravi võimalikult kiiresti.